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Western試驗常見問題

Western試驗中常見問題分析:

1. 在western實驗中,通常有人采用TBS,有人采用PBS,在使用中有什么區別?

選擇合適的緩沖液對于維持一定pH值下蛋白質的穩定及保證實驗的重復性是很重要的。PBS的緩沖能力強于TBS(因為混合緩沖液在一定的離Western試驗中常見問題分析子強度下常常具有更寬的緩沖范圍),TBS在pH7.0以下緩沖能力較弱(不過PBS易污染)。但我們常常要根據我們實驗目的選用合適的緩沖液,如在蛋白純化中進行陰離子交換層析,陽離子緩沖液首選TBS;陽離子交換層析時,陰離子緩沖液則首選PBS。

western blot中使用TBS和PBS均可,只是要根據需要選擇合適的濃度。

2. 沒有注明可以用來做western blot的一抗,可以用來做western blot嗎?

不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構象型表位的,識別構象型表位的抗體不能用于western blotting,因為在western blotting中抗體識別的是完全變性的蛋白質抗原,而蛋白質抗原的構象型表位變性時被破壞。

3. 做western每次只加一種一抗,可以同時加兩種或者多種一抗的嗎?

最好還是不要同時加兩種一抗。因為如果結果里面有非特異信號的話,就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL顯色、壓片、洗片;漂洗以后,再上內對照的一抗、二抗,ECL顯色、壓片、洗片。

4. Western blot 使用的膜哪種最好啊,PVDF好還是NC膜,如何選擇?

PVDF膜價格較貴,可重復使用,特別適合蛋白印跡,結合能力較強。NC膜價格比較便宜,應用較廣,結合牢固性差一些,韌性也不如PVDF,不能重復使用,但蛋白吸附容量高,親水性較好。這兩種膜都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關文獻。

5. 為什么出現了多條帶,每個加樣槽中都出現了多條帶,而且好象都很有規律,為什么?是封閉時間不夠嗎?做western必須要內參嗎?

一抗、或二抗抗體濃度太高,多克隆抗體本身的非特異性反應,抗體的特異性不強,目的蛋白經過處理后發生變化,而內參的條帶基本均勻一致。這樣才有說服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認為的造成目的條帶濃度的變化,所以嚴格意義上說,內參是必須做的。

6. Western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些?用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求?

作為western來講,理論上單抗比多抗的特異性要好,但單抗種類較少一般價格偏高,所以一般情況下可以使用多抗。用于western的抗體和用于ELISA的抗體:用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性;而用于ELISA的抗體則要看抗原種類,有些是識別氨基酸序列特異性,有些是識別構像特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。

做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題,一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白,另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。

7.  半干轉是否要求膜,濾紙,膠同樣大小?因為膠大小不一定規則,膜和濾紙會大一點,那樣會不會短路?什么是短路?如何控制和發現短路呢?

可以相等,但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了,上下兩層濾紙也不能因過大而相互接觸,這樣同樣會短路,電流不會通過膠和膜。轉移前和轉移過程中看看電壓就行,正常的半干是慢慢變高的,最后結束時一般是開始的1.5~3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。

8. Western哪種染色好?

1) 陰離子染料是較常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測極限可達到1.5μg,考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去,以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是:溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用語正電荷的膜。靈敏度低。

2) 膠體金,靈敏度高,檢測范圍可到pg級,但染色比穩定。

9. 不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上,轉移效率低怎么樣解決?

可以考慮:轉移緩沖液中加入20%甲醇(終濃度),因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率,但可增加蛋白質和NC膜的結合能力,甲醇可以防止凝膠變形,甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間;轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉移效率;用優質的轉移膜,或使用小孔徑的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交聯;低濃度膠,如低至6%。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠;提高轉移電壓/電流;增加轉移時間。

10. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么?

DAB顯色在辣根過氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產物,該產物難溶于醇和其他有機溶劑,DAB的氧化還能引起聚合作用,導致與四氧化鋨反應而增加其染色強度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中,酶將奈酚磷酸(底物)水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽(顯色原)結合而產生有色的、不溶性偶氮染料。

11. 酶顯色與熒光顯色之間,各自的優缺點是什么?

免疫酶技術就是用酶(如辣根過氧化物酶)標記已知抗體(或抗原),然后與組織標本在一定條件下反應,如果組織中含有相應抗原(或抗體),抗原抗體相互結合形成的復合物中所帶酶分子遇到底物時,能催化底物水解、氧化或還原,產生顯色反應,這樣就可以識別出標本抗原(抗體)分布的位置和性質,通過圖像分析并可達到定量的目的。

免疫熒光技術雖已廣泛應用于免疫學的研究與診斷,但是熒光抗體染色標本不能長期保存,對組織細胞的細微結構分辨不清,免疫酶技術則能克服上述不足,標記免疫酶技術的敏感性更優于免疫熒光法,對石蠟切片標本尤為適用,為免疫病理研究開辟了一條新途徑,酶顯色產物具有較高的電子密度,經過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察,免疫酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術,前者是將酶通過交聯劑結合在抗體分子上,形成酶標記抗體。后者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的免疫反應,稱為非標記抗體酶技術。


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